Introdução

Atualmente, várias técnicas que geram marcadores moleculares estão disponíveis e estão sendo empregadas para a caracterização de germoplasma, para estudos básicos de genética, para estimar a diversidade genética ou para seleção assistida das plantas melhoradas por meio de seleção indireta, entre outras inúmeras utilizações. Aliadas à identificação de acessos superiores do ponto de vista agronômico, elas contribuem para os programas de melhoramento genético.

O produto utilizado nas análises genéticas, realizadas com base em marcadores moleculares, é o DNA (ácido desoxirribonucléico). Sendo assim, a eficiência destas análises é essencialmente dependente da qualidade e da quantidade do DNA extraído. Em plantas, vários fatores podem influenciar estas características, incluindo desde os procedimentos para a coleta e armazenamento do tecido vegetal até o processo de extração de DNA e de armazenamento do DNA extraído.

Vários métodos de extração de DNA de plantas têm sido descritos na literatura. O fundamentado na utilização do detergente brometo de cetiltrimetilamônio (CTAB) (Doyle & Doyle, 1987) é citado como o mais utilizado para a extração de diferentes espécies vegetais. Basicamente, os protocolos são utilizados com algumas modificações visando solucionar problemas intrínsecos da espécie analisada (Ferreira & Grattapaglia, 1996).

Os objetivos deste documento são descrever a metodologia de extração de DNA genômico, ajustada no laboratório de Biotecnologia da Embrapa Trigo para os cereais de inverno: trigo, cevada e triticale, a partir do protocolo utilizado por Saghai-Maroof et al. (1984) baseado na utilização de CTAB e tecer considerações sobre as etapas do processo, observadas especificamente para essas gramíneas, como referência atualizada e específica a ser utilizada em trabalhos correlatos.

Metodologia

1- Pesar aproximadamente 300 mg de tecido foliar fresco.
2- Macerar com nitrogênio liquido, cuidando para o tecido não descongelar.
3- Adicionar às amostras, 700 µl de tampão de extração CTAB (Tabela 1) pré-aquecido a 65°C e misturar bem.
4- Incubar as amostras a 65°C em banho-maria (ou hibridizador) por 60 min., invertendo os tubos, gentilmente, a cada 10 min.
5- Retirar do banho-maria (ou hibridizador) e deixar esfriar em temperatura ambiente por 5 min.
6- Adicionar 1 volume (700 µl) de clorofórmio-álcool isoamílico (24:1). Inverter gentilmente por 10 min.
7- Centrifugar a 10.000 rpm por 7 min.
8- Retirar o sobrenadante para novos tubos e adicionar 1 volume (700 µl) de clorofórmio-álcool isoamílico (24:1). Inverter gentilmente por 10 min.
9- Centrifugar a 10.000 rpm por 7 min.
10- Retirar o sobrenadante para novos tubos e adicionar 500 µl de isopropanol (-20°C).
11- Misturar para precipitar o DNA.
12- Incubar a -20°C por, no mínimo, 30 min. Ou neste passo pode deixar “over night”.
13- Centrifugar a 10.000 rpm por 5 min.
14- Retirar o sobrenadante e deixar o pellet.
15- Lavar o pellet com aproximadamente 600 µl de etanol 70% (-20°C).
16- Descartar o etanol 70%.
17- Lavar o pellet com aproximadamente 600 µl de etanol 96%
18- Descartar o etanol 96% e deixar secar a temperatura ambiente.
19- Ressuspender o pellet em TE: 50 ou 100 µl.
20- Adicionar 3 ul de RNAse (10 mg/ml). Misturar e incubar por 1 h a 37°C.
21- Armazenar as amostras a -20°C ou a -80°C até o momento de uso.

Considerações gerais

A obtenção do material vegetal mais comumente utilizada é através de tecido foliar. Entretanto, é possível utilizar
sementes, raízes, endosperma, e cultura de células em suspensão.

Para o procedimento de amostragem do tecido foliar, indica-se preferencialmente a coleta de tecido novo, onde ocorre a fase ativa de crescimento das plantas (Fig. 1). A extração pode ser realizada logo após a coleta, de preferência, mantendo resfriado ou congelado em nitrogênio líquido. No caso de armazenamento por períodos mais longos, é possível manter congelado a -20°C, a -80°C ou liofilizado a 4°C.

Considerando que para as técnicas baseadas em PCR (Reação em Cadeia da Polimerase) somente alguns miligramas de tecido fresco são suficientes para gerar a quantidade necessária de DNA, o protocolo foi adaptado para realização em microtubos (2,0 e 1,5 ml) o que reduz o gasto de reagentes e o custo por amostra (Fig. 2).

Na maceração mecânica, onde há o rompimento das paredes e membranas celulares do tecido, deve-se cuidar para manter as folhas congeladas pela adição de nitrogênio líquido. Em etapa seguinte, o tecido macerado é suspendido em um tampão de extração, contendo o detergente catiônico CTAB, para solubilizar as membranas protéicas (Fig. 3). Para a solubilização e ação do CTAB é adicionada uma concentração de 1,4 M NaCl e é utilizado um sistema Tris-HCl pH 8,0 para manutenção do pH constante. Outros componentes desse tampão visam proteger o DNA da ação de enzimas nativas ou compostos secundários liberados com o rompimento das células. O EDTA (etilenodiaminotetracetato) quela cátions divalentes tais como Mg2+ e Ca2+. Originalmente utiliza-se o 2-mercaptoetanol, um agente redutor que desnatura proteínas como peroxidases e polifenoloxidases. Entretanto, após testes no laboratório de Biotecnologia da Embrapa Trigo, verificou-se que não é necessário a adição deste componente no tampão para as espécies em estudo, além de se eliminar um produto altamente tóxico nesse processo.

Após o procedimento com o tampão de extração, o material é submetido a uma extração com solvente orgânico, clorofórmio-álcool isoamílico, seguida de centrifugação para separação da fase orgânica da fase aquosa (Fig. 4). Na fase orgânica, que fica na parte inferior da solução, são retidos e descartados os lipídeos, proteínas e alguns polissacarídeos. Na fase aquosa ficam o DNA e alguns contaminantes como RNA e alguns polissacarídeos. Esta etapa é repetida para purificar o DNA dos contaminantes, diferente do protocolo original que faz esta purificação apenas uma vez.

Posteriormente, na presença de um sal e de um álcool o DNA é precipitado e, então, sedimentado por centrifugação (Fig. 5). Seguem-se a lavagem do DNA com etanol 70% e a secagem à temperatura ambiente.

Finalmente, o DNA é suspenso em um tampão TE (Tris-EDTA), e é realizado um tratamento com RNAse, para eliminação do RNA. Após, o DNA estará em condições de uso ou poderá permanecer armazenado na forma concentrada em condições de -20°C ou -80°C. A diluição para uma solução de trabalho é feita com água miliQ.

A verificação da concentração e qualidade final do DNA extraído pode ser verificada pela visualização em gel de agarose, comparando-se com padrões de concentrações moleculares conhecidas (Fig. 6).

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Referenciação

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