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METODOLOGIAS PARA ESTUDO DE RESISTÊNCIA GENÉTICA DE TRIGO E DE CEVADA A OÍDIO
A doença conhecida como oídio é causada pelo fungo biotrófico Blumeria graminis, o único que pode atacar várias espécies de gramíneas, como trigo, cevada, aveia e centeio. Em cereais de inverno, caracteriza-se pela presença de colônias de aspecto pulverulento, branco-acinzentadas, formadas por micélio ectofítico, conidióforos e conídios, na superfície de órgãos aéreos, especialmente folhas, podendo ocorrer em bainhas foliares e em espigas. Abaixo do micélio, o tecido do hospedeiro torna-se clorótico ou necrótico e, em casos graves, as folhas morrem. Estruturas de frutificação do fungo, negras e esféricas, são facilmente observadas sobre micélio antigo.
O termo "oídio" tem sido usado para designar a doença e também o grupo de fungos ascomicetos pertencente à ordem Erysiphales, família Erysiphaceae. O gênero Blumeria diferencia-se do gênero Erysiphe pela formação de haustórios digitados e pela presença de células basais bulbosas dos conidióforos, além da restrita relação de hospedeiros. Existem duas "forma specialis" em Blumeria graminis, ou seja, especializações em espécies hospedeiras, no caso trigo (f. sp. tritici) ou cevada (f. sp. hordei). Quando na forma assexual, é classificado como Oidium monilioides (Nees) Link, ordem Moniliales, família Moniliaceae (Stadnick, 2001).
Oídio de trigo, doença causada por Blumeria graminis (DC.) E.O. Speer f. sp. tritici Em. Marchal (sinamorfo Erysiphe graminis DC. f. sp. tritici Em. Marchal), ocorre de forma endêmica em áreas tritícolas de clima frio e úmido no Brasil, especialmente na Região Sul e em lavouras sob sistema irrigado nas Regiões Centro-Oeste e Sudeste. É citado como problema no Leste dos Estados Unidos da América e em países do Cone Sul da América do Sul e da Europa (Linhares, 1988b, 1988c; Kohli, 1996; McIntosh, 1998; Niewoehner & Leath, 1998). Na média dos anos, as perdas de rendimento de grãos de trigo decorrentes da doença alcançam de 5% a 8% (Szunics et al., 2001). Em Passo Fundo, RS, há registros de perdas entre 10% e 62% (Fernandes et al., 1988; Linhares, 1988b; Reis et al., 1997).
Oídio de cevada, causado por Blumeria graminis (DC.) Golovin ex Speer f. sp. hordei (sinamorfo Erysiphe graminis DC. f. sp. hordei Em. Marchal), é uma das principais doenças desse cereal na Europa, onde epidemias são comuns. No Brasil, foi uma das moléstias mais severas nas safras de cevada de 1999 e de 2000 (Minella, 2000, 2001). Pode levar a reduções no rendimento de grãos de 10%, em média, e em anos favoráveis, a redução é superior a 20% na Europa e superior a 30% no Norte da África (Czembor, 2000).
Tanto em trigo como em cevada, os danos causados por oídio podem ser maiores que a redução de rendimento de grãos, em virtude da necessidade de substituição de cultivares suscetíveis por resistentes (Martinelli, 2001). Poucas cultivares comerciais de trigo mantiveram-se resistentes por mais de oito anos, como ‘Maris Huntsman’, na Inglaterra, ‘Knox’ e ‘Knox 62’, nos Estados Unidos da América, ‘Diplomat’, na Alemanha, e ‘Est Mottin’, na Itália (Bennett, 1984).
Estudos sobre resistência genética de linhagens de trigo e de cevada a oídio são usados na descrição do comportamento de cultivares a essa doença, fornecendo informações importantes aos agricultores sobre necessidade de controle. Para melhoristas, essas informações auxiliam na seleção de linhagens com características desejáveis (Costamilan, 2000; Reunião, 2002). Além disso, análise de isolados de oídio, coletados em diferentes regiões produtoras, indica ocorrência de variabilidade interna na população do patógeno e efetividade de genes de resistência (Costamilan e Linhares, 2002; Niewoehner & Leath, 1998).
A descrição de métodos de estudo é importante para padronização de ações visando comparação de resultados e intercâmbio de informações. Assim, este documento foi realizado com objetivo de compilar metodologias para avaliação de resistência genética de trigo e de cevada a oídio, tanto em inoculação artificial em plântulas quanto em avaliação de resistência de plantas adultas, em campo.
OBTENÇÃO DE INÓCULO DE OÍDIO
O inóculo de oídio usado em casa de vegetação, chamado de inóculo inicial, é composto por mistura de diversas populações, originárias de várias fontes. Além disso, serve para estudos envolvendo distribuição geográfica de biótipos de oídio predominantes e efetividade de genes de resistência do hospedeiro. Assim, procedimentos adequados de coleta e de envio de amostras de populações de oídio são essenciais para obtenção de material viável para uso em casa de vegetação, principalmente por tratar-se de microorganismo biotrófico que apresenta grande variação na composição da população. O acondicionamento e a rapidez de entrega de amostras de oídio são importantes na manutenção da viabilidade de isolados, possibilitando eficiente e rápida recuperação, isolamento e multiplicação.
As plantas infectadas, escolhidas para coleta, não devem ter recebido aplicação de fungicidas anteriormente, ou estarem localizadas próximas a plantas já tratadas, para assegurar a viabilidade do isolado. Devem ser escolhidas folhas com pústulas de coloração ainda branca, não sendo necessárias mais que cinco folhas infectadas, por amostra. Devido à característica de desenvolvimento superficial do patógeno, recomenda-se que as folhas de trigo ou de cevada com oídio sejam protegidas de dessecação, sendo envolvidas por outras folhas verdes sadias ou mesmo por folhas de outras espécies de plantas, colocando-se o conjunto dentro de embalagem de papel. A seguir, identifica-se a embalagem com nome da cultivar ou linhagem, local, data de coleta e coletor. No caso de coletas realizadas durante viagens, as folhas com oídio não devem ser deixadas em veículos, roupas etc., pois o risco de dessecação é grande. As amostras podem ser mantidas em geladeira por, no máximo, oito dias. Nesse caso, procurar envolver as folhas em papel toalha umedecido.
Quando as folhas recebidas estiverem secas, com pústulas escuras e com poucos conídios, recomenda-se envolver a amostra em folha de papel toalha levemente umedecido e colocar o conjunto em temperatura baixa (geladeira à, aproximadamente, 4 ºC) de 12 horas a três dias. Esse procedimento auxilia na reidratação do patógeno e na recuperação do isolado.
A coleta de populações predominantes de oídio em determinada região pode ser realizada com iscas de plantas de cultivares suscetíveis, semeadas em copos ou vasos. Após oito dias da semeadura, essas plantas são levadas ao campo e colocadas próximas a plantas doentes. Após dois a três dias, são novamente recolhidas para casa de vegetação. Colônias novas podem ser observadas após uma semana.
MANUTENÇÃO E MULTIPLICAÇÃO DE INÓCULO
Oídio, por ser organismo biotrófico, necessita tecido vivo para desenvolvimento. A manutenção de inóculo pode ser realizada em plantas vivas, sucessivamente semeadas e inoculadas, ou em folhas verdes destacadas e conservadas em meio de cultura próprio, durante certo período.
1) Em plantas vivas, é necessário cultivar plantas matrizes, normalmente de cultivares suscetíveis, em períodos que variam entre 10 e 15 dias, dependendo da temperatura ambiente. Com temperatura mais amena, como a que ocorre no inverno, o período entre as inoculações pode ser de, até, 15 dias. Em períodos de temperatura elevada, como é o caso do verão, as inoculações ocorrem mais freqüentemente, pois as plantas hospedeiras morrem rapidamente e não mantêm, por muito tempo, colônias viáveis de oídio. Essas plantas matrizes servem tanto para manutenção de inóculo durante períodos em que não estão sendo realizados testes, como para fonte de inóculo para infectar genótipos de trigo e de cevada.
É importante que, a cada ano, o inóculo seja renovado pela agregação de inóculo originário de campo, tanto de locais próximos quanto de várias regiões produtoras, visando maior representatividade com diferentes populações do patógeno.
2) Pelo método em folha verde destacada, usam-se pedaços de folha com três cm de comprimento, coletadas dez dias após semeadura, retirados da porção média de folhas primárias de genótipos suscetíveis, e colocados em placas de Petri com água-ágar a 0,5%, acrescido de 50 ppm de benzimidazole. Em cada placa, são colocados três pedaços de folhas. Essas placas devem ser preparadas 12 horas antes, para que as folhas recuperem o turgor. A inoculação é realizada com conídios formados em folhas infectadas de cultivar suscetível, dispersos por torre de aspersão com densidades de inóculo entre 200 e 400 conídios/cm2 e mantidos a 17 ºC e baixa intensidade luminosa por 10 a 14 dias até avaliação (Heun & Fischbeck, 1987; Leath & Heun, 1990).
AVALIAÇÃO EM PLÂNTULA
Diferenças quantitativas quanto à severidade de oídio podem ser observadas tanto em estádio de plântula quanto no estádio de planta adulta, sendo que essas reações nem sempre correspondem. Em plântulas, resistência do tipo quantitativa pode ser eficientemente detectada. Avaliações de resistência de plântulas de trigo ou de cevada são realizadas em casa de vegetação.
As sementes dos genótipos a serem testados são semeadas em copos plásticos de 20 ml de volume, perfurados no fundo, contendo mistura de 20% de terra vegetal e 80% de terra de campo previamente adubada, conforme necessidade. São depositadas cerca de 30 sementes por copo, sendo preparados dois copos por genótipo de trigo ou de cevada. A cada 10 genótipos, são semeados dois copos com a cultivar testemunha IAS 54, no caso de trigo, e com a cultivar Antarctica 5, no caso de cevada.
Os copos assim preparados são colocados sobre bandeja e levados para casa de vegetação. A temperatura pode variar entre 17 ºC e 25 ºC e não há necessidade de controlar o fotoperíodo e a umidade ambiente, no período pós-semeadura. No início, não deve haver água em excesso no substrato, o que causa o apodrecimento de sementes ou dificulta a emergência de plantas. Após, a irrigação pode ser realizada diariamente, ou conforme a necessidade. Em períodos de temperatura amena, como inverno, a necessidade de água é menor que em períodos de temperatura mais elevada.
De sete a nove dias após a semeadura dos genótipos a ser avaliados, ou quando as plântulas apresentarem a segunda folha, é realizada inoculação de oídio, de acordo com os seguintes procedimentos, baseados em Linhares (1988c) e apresentados na Figura 1:
A leitura da reação a oídio em plântulas é realizada de dez a 12 dias após inoculação. As escalas de avaliação da reação de genótipos de trigo e de cevada a oídio mais comuns são as seguintes:
AVALIAÇÃO EM PLANTA ADULTA
Resistência de planta adulta, ou de campo ou "slow-mildewing" (desenvolvimento lento de oídio) são sinônimos que podem ser definidos como "resistência que permanece efetiva por muitos anos enquanto a cultivar está sendo usada em área suficientemente grande para favorecer a seleção de raças mais virulentas de um determinado patógeno". Esse tipo de resistência é muito procurado, embora o desenvolvimento de cultivares com essa característica seja, muitas vezes, casual, pois não há meios totalmente efetivos de seleção para resistência durável. É difícil distinguir entre resistência quantitativa ou durável durante o processo de seleção, o que se torna mais claro após vários anos de uso de uma cultivar (Bennett, 1984).
Avaliações em campo, sob inoculação natural, devem ser realizadas em local com população de oídio bem estabelecida e com alta pressão de patógeno, condições essas que atuam como pressão seletiva e influenciam a evolução de resistência específica em populações compostas (Paillard et al., 2000).
Escalas para medição de avaliação quantitativa de doença foliar dificilmente serão interpretadas da mesma forma por todos avaliadores. Por isso, é importante a realização de treinamentos com pessoal técnico experiente, visando, principalmente, à identificação de reações de resistência e de suscetibilidade entre genótipos de trigo ou de cevada. Para quantificação de reação em campo, são sugeridas as seguintes escalas:
Treinamento para avaliação de área foliar infectada por oídio pode ser realizado através do programa DISTRAIN (Disease Trainning), desenvolvido pelo Departamento de Agricultura dos Estados Unidos da América (USDA – APHIS). O programa apresenta várias imagens coloridas de folhas de cereais com diferentes áreas cobertas por oídio, além de outras manchas foliares, e solicita um valor de avaliação de severidade. As estimativas feitas pelo usuário são comparadas à área real, que é fornecida pelo programa (Tomerlin & Howell, 1988).
AVALIAÇÃO DE VARIABILIDADE GENÉTICA DE ISOLADOS DE OÍDIO
O controle de oídio em trigo e em cevada pode ser obtido por meio de resistência genética em cultivares comerciais, porém o patógeno apresenta especialização fisiológica. Cultivares com poucos genes de resistência exercem pressão de seleção, levando a alterações na freqüência de genes do patógeno, tornando-o capaz de infectar cultivares consideradas resistentes em anos anteriores (Bennett, 1984; Niewoehner & Leath, 1998). Por isso, levantamentos periódicos e em larga escala da freqüência de virulência da população de B. graminis são necessários para identificar genes de resistência com efetividade, além de detectar alterações de virulência, diversidade genética e padrões geográficos de distribuição da população do patógeno, auxiliando na escolha de fontes de resistência para uso em programas de melhoramento (Niewoehner & Leath, 1998).
1 - Biótipos de trigo
A cada ano, verifica-se ampla variabilidade entre populações de oídio em trigo. Em 1975, Reis et al. (1979) encontraram evidências da ocorrência de diferentes raças fisiológicas de oídio de trigo no Rio Grande do Sul. Linhares (1988a) concluiu que não houve modificação da composição de genes de resistência entre inóculos de oídio ocorrentes entre 1980 e 1986 em diferentes regiões brasileiras. Nos Estados Unidos da América, Niewoehner & Leath (1998) detectaram virulência crescente a diferentes genes de resistência e aumento na complexidade dos isolados. Na Hungria, Szunics et al. (2001) observaram considerável alteração na composição racial e nas raças predominantes desde 1971, sendo que, de 78 raças constatadas, apenas 11 foram continuamente detectadas por mais de 15 anos. Costamilan & Linhares (2002), analisando isolados brasileiros coletados nos anos de 1995, 1996, 1997, 1999 e 2000, observaram que os genes Pm2 e Pm4a+... permaneceram efetivos a todos os isolados. Isolados apresentando virulência a cinco genes ou combinações foram mais freqüentes em 1995 e em 1997, a seis em 1999 e a sete em 2000, o que pode significar aumento na complexidade da composição racial do patógeno. Durante os anos analisados, foram identificadas 90 combinações diferentes de reações de resistência (genes efetivos) e de suscetibilidade (genes inefetivos) entre as cultivares da série diferencial a B. graminis f. sp. tritici.
Inóculo de amostras coletadas em diferentes locais, para estudos de variabilidade genética, deve ser mantido isolado, a fim de evitar contaminação. Para tanto, plântulas de cultivar suscetível infectada com tais amostras são mantidas dentro de gaiolas de plástico, que podem ser confeccionadas com duas garrafas plásticas transparentes sobrepostas, sem fundo, com duas a três aberturas cobertas com tela de malha fina, a fim de facilitar trocas gasosas.
Os testes são realizados em casa de vegetação, com temperatura variando entre 17 ºC e 25 ºC. Com espátula, os conídios das amostras originais são transferidos de folhas coletadas no campo para folhas de cultivar suscetível IAS 54, com, aproximadamente oito dias. Após 15 dias, ou quando são visíveis as primeiras pústulas, três isolados são obtidos de cada amostra, cada um oriundo de uma pústula diferenciada, sendo novamente transferidos com espátula para novas plantas da cultivar testemunha e multiplicados separadamente várias vezes, formando três repetições por amostra. As repetições devem ser mantidas isoladas, de acordo com as diferentes origens, fazendo com que os conídios não contaminem diferentes amostras. O material inoculado retorna para casa de vegetação por 12 dias e é reinoculado sucessivamente, até se obter inóculo suficiente para o teste na série diferencial. Os procedimentos de coleta de pústulas e acondicionamento de isolados podem ser observados na Figura 6.
No caso de isolados que formam estruturas de reprodução (cleistotécios ou peritécios), com ascosporos viáveis, em folhas secas ou senescentes, sugere-se realizar indução de diferenciação e liberação de ascosporos, através de técnica descrita por Niewoehner & Leath (1998). Corta-se um segmento de 2,5 cm de comprimento de folhas com peritécios, que são montadas em papel filtro umedecido, na face interna de tampa de placa de Petri. A base da placa é preenchida com meio ágar-água a 0,5%, acrescido de benzimidazole a 50 mg/litro, sobre o qual são colocados pedaços de folhas verdes de cultivar suscetível. Colocam-se as placas em câmara de crescimento a 17 ºC e 12 horas de luz fluorescente. Ascosporos diferenciam-se e são dispersados entre quatro a seis dias. O fungo esporula sobre as folhas destacadas 14 a 18 dias após. Conídios são, então, transferidos usando-se pincel a partir de uma pústula isolada para folhas destacadas novas. O fungo é transferido a cada 12 a 14 dias para novas folhas de trigo.
Plantas de trigo da série diferencial de raças, com oito dias de idade, são inoculadas com os isolados mediante agitação de folhas infectadas da cultivar suscetível. A série diferencial de trigo para identificação de raças, ou biótipos, de oídio é composta por cultivares contendo genes ou combinações de genes conhecidos para resistência a oídio, além da testemunha suscetível IAS 54. Na Tabela 4 é apresentada a lista de cultivares mais freqüentemente usada. A lista completa de cultivares contendo genes de resistência a oídio de trigo é apresentada em McIntosh et al. (1998).
É importante que haja intervalo de, pelo menos, dez minutos entre a inoculação de isolados na série diferencial, para evitar contaminação entre amostras. Nesse período, deve-se borrifar o ambiente com água, para promover a queda de conídios que se encontram suspensos no ar. Os copos contendo genótipos da série diferencial são colocados sobre bandeja e levados para interior de recipiente retangular sem fundo, fechado por vidro no topo e por tecido de malha fina em quatro laterais, a fim de impedir contaminação entre amostras. A leitura da reação ocorre entre 10 e 12 dias pós inoculação, usando-se a escala apresentada na Tabela 1. Na Figura 7, são apresentadas algumas imagens desses procedimentos.
São considerados resistentes os genótipos que apresentam reação até valor 2+ e suscetíveis, acima de 3-, determinando-se fórmulas de virulência conforme a composição de reações R (resistente) ou S (suscetível) para cada gene testado. Os biótipos (ou raças) são diferenciados quando não há correspondência de mesma reação R ou S nas cultivares da série diferencial. Dois isolados com os mesmos resultados R ou S na seqüência de genes são considerados iguais. Com essa avaliação, pode-se definir a existência de populações semelhantes ou diferentes do patógeno entre as amostras, além de constatar a efetividade de genes de resistência.
2 - Biótipos de cevada
Blumeria graminis f. sp. hordei interage especificamente com cultivares de cevada. Para cada gene de resistência no hospedeiro corresponde um gene de avirulência no patógeno, conforme conceito de interação gene-para-gene. Já foram identificados mais de 100 genes de resistência em cevada e mais de 25 genes de avirulência foram descobertos no patógeno (Czembor, 2000, Caffier et al., 1996). Na Europa, o uso de genes específicos de cevada para resistência a oídio iniciou na década de 1930. Os genes comumente usados são Mla6, Mla7, Mla9, Mla12 e Mla13, do locus Mla, e os alelos de resistência Mlk, Mlg, MlLa, Mlh e Mlra. Entretanto, após quatro a cinco anos do lançamento de cultivares contendo esses genes, raças virulentas de oídio conseguem superar a resistência (Czembor, 2000).
Os testes para constatação de variabilidade genética são realizados em casa de vegetação, com temperatura variando entre 17 ºC e 25 ºC e luz natural, e seguem a mesma estrutura descrita para trigo: iniciam com coleta de conídios do material original, seguida pela purificação e multiplicação do fungo na cultivar suscetível Antarctica 5. A seguir, são obtidos três isolados de cada amostra a partir de lesões individualizadas, cada um sendo multiplicado separadamente várias vezes, a fim de garantir a pureza e aumentar a quantidade de conídios. Cada isolado é inoculado em plantas de cevada da série diferencial (Tabela 5), na expansão da primeira folha, agitando-se vigorosamente folhas da cultivar suscetível infectadas com o isolado. A leitura da reação ocorre de oito a dez dias após, usando-se a escala expressa na Tabela 1, sendo resistente o material que desenvolve o tipo de infecção descrito até nota 2+ e suscetível a partir desse nível.
A série diferencial usada na identificação de virulência foi desenvolvida por Kølster et al. (1986) e por Caffier et al. (1996) e é, em sua maioria, formada por linhas quase-isogênicas desenvolvidas a partir da cultivar Pallas, tendo cada linha um gene de resistência identificado pelas letras Ml. Os biótipos são numerados de acordo com a combinação de reações de resistência ou de suscetibilidade conferidas pelos genes das cultivares da série diferencial, determinando-se as fórmulas de virulência, de modo que não haja dois biótipos com a mesma seqüência de genes inefetivos ou efetivos.
1Pesquisadora do Centro Nacional de Pesquisa de Trigo, da
Embrapa, Caixa Postal 451, 99001-970 Passo Fundo, RS. E-mail:leila@cnpt.embrapa.br
Documento Online Nº 14
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