Circular Técnica Online Nº 13 - Publicações

Material e Métodos

Foram analisadas linhas isogênicas de trigo portadoras dos genes de resistência de plântula, à ferrugem da folha, quais sejam Lr9 (oriundo de Aegilops umbellulata), Lr16 (Triticum aestivum), Lr19 (Agropyron elongatum), Lr24 (A. elongatum) e Lr26 (Secale cereale). Para cada linha isogênica, foram analisadas oito amostras em duas repetições, totalizando 16 amostras. Tais amostras constituíram dois grupos de análises: grupo I, com inoculação de P. triticina, e grupo II, sem inoculação. A formação desses dois grupos visou à análise qualitativa e quantitativa das esterases em relação à resistência à ferrugem da folha do trigo.

Primeiramente, as sementes oriundas do Banco Ativo de Germoplasma da Embrapa Trigo, foram colocadas em papel germitest umedecido com água destilada, a fim de promover a germinação. Quando a planta apresentava-se na fase de primeira folha, com 8 a 10 centímetros de comprimento, foram coletadas amostras dos ápices foliares, medindo dois centímetros, as quais foram devidamente identificadas e congeladas até o uso nas análises eletroforéticas. Após essa fase de coleta de tecido foliar, as mesmas plantas (grupo I e II) foram transferidas para potes com terra, sendo mantidas em casa de vegetação sob condições controladas de luz e de temperatura, a fim de serem realizadas as avaliações fitopatológicas. Para essa segunda fase, foram inoculadas separadamente 3 raças de Puccinia triticina nas oito plantas de cada linha isogênica (grupo I). O método de inoculação usado foi de acordo com a rotina do laboratório de ferrugem da folha da Embrapa Trigo. As avaliações fitopatológicas foram feitas 15 dias após a inoculação e representadas por (0) (;) (1) (2), como resistentes, e (3) (4) como suscetíveis, de acordo com escala específica sugerida por Roelfs et al. (1992) para o estádio de plântula (Figura 1). Para a análise das esterases, os géis foram colocados sobre um visualizador com luz fluorescente, o que permitiu que fossem desenhadas as bandas representativas de cada amostra, em papel milimetrado, para posterior cálculo da migração relativa das bandas no gel. As plantas que apresentaram padrão de bandas idêntico foram agrupadas em um único zimograma. Quando plantas-irmãs apresentaram padrões diferentes, seja por variações qualitativas ou quantitativas, esses padrões foram individualizados, sendo indicado o número de plantas que apresentaram cada padrão.

A seguir, será descrito o processo metodológico usado para as análises e identificação do marcador isoesterásico associado ao gene Lr24. A Figura 2 apresenta as principais etapas envolvidas :

Confecção do gel

Sistema enzimático: esterase (EST)

Concentrações dos géis: 7%

Tampões: segundo Scandalios (1969)

Tampão do gel: 9 partes da solução B: 1 parte da solução A

Tampão das cubas eletrolíticas:

Solução A: tampão barato de lítio 0,24M; pH 8,3

Hidróxido de lítio, anidro 1,20 g

Ácido bórico anidro 11,89 g

Água destilada até 1.000 ml

Solução B: tampão tri-citrato 0,0595M; pH 8,3

Tris 7-9 hidroxi-metil-aminometano anidro 6,20 g

Ácido cítrico anidro 1,60 g

Água destilada até 1.000 ml

Para cada gel, foram usados 100 ml do tampão do gel, sendo adicionado 6,65 g de acrilamida e 0,35 g de bis-acrilamida. Após a perfeita solubilização destes componentes, adicionaram-se 100m l de TEMED e 1.000m l de persulfato de amônio a 10%. Essas soluções, após agitação, foram colocadas em canaletas de vidro com dimensões de 18,0 cm x 18,0 cm x 0,2 cm, cobertas com uma placa de vidro. A polimerização do gel ocorreu à temperatura ambiente por cerca de 20 minutos, sendo as placas com o gel transferidas para 4 ºC onde permaneceram até seu uso.

Preparo das amostras

O ápice foliar, previamente congelado, foi homogeneizado, manualmente, com auxílio de um bastão de vidro com ponta esmerilhada, junto com o tampão do gel de Scandalios (1969), em placas de acrílico. A placa foi mantida sobre gelo, a fim de evitar a desnaturação das enzimas. Sobre o homogeneizado, foi colocado um disco de papel absorvente branco e liso, cortado com picotador. O papel usado foi previamente lavado com solução de bicarbonato de sódio 0,1N e solução de ácido acético 0,05M com EDTA 0,01M. Sobre esse papel foram colocados os papéis de aplicação das amostras.

Aplicação das amostras nos géis

Cada retângulo de papel, com a amostra, foi aplicado no respectivo gel, após a remoção da placa de vidro que cobria a canaleta, sendo inserido em um dos cortes feitos usando-se um pente de aço inoxidável de 26 "dentes", de 4,0 mm de comprimento cada um. Nessa etapa também foi mantida a placa sob gelo.

Migração das amostras

Os géis com as amostras aplicadas foram colocados em cubas eletroforéticas horizontais, mantidas em balcão refrigerador especial, em temperatura constante de 4 ºC. A linha do ponto de aplicação foi mantida à distância de 1,0 cm da ponte catódica. A distância entre a ponte catódica e anódica foi de 12,0 cm. A migração das amostras foi interrompida quando a linha de frente, marcada com azul de bromofenol, atingiu 9,0 cm para as EST.

Revelação dos géis

A técnica empregada foi a descrita por Scandalios (1969), modificada:

Tampão C + D 50 ml

Alfa-naftil acetato 1,5 ml

Beta-naftil acetato 1,5 ml

Fast blue BB salt 0,02 g

Tampão C: fosfato de sódio monobásico 0,2M; pH 4,3

NaH₂PO₄27,6 g

Água destilada até 1.000 ml

		13
		Dezembro, 2002 Passo Fundo, RS

Circular Técnica Online Nº 13 Publicações Online