Dezembro, 2007	85
		Passo Fundo, RS

Os marcadores citogenéticos, como os marcadores de DNA, têm sua expressão independente das variações ambientais ou da ativação gênica, tornando-os caracteres muito confiáveis. Atualmente, grande ênfase está sendo dada para a técnica de Hibridização In Situ (HIS) ou In Situ Hybridization (ISH), sendo que seu desenvolvimento marcou a transição da era da citogenética clássica para a era da citogenética molecular, uma vez que esta técnica proporciona a interação entre conhecimento da biologia celular, citogenética clássica e genética molecular. Baseia-se no fato do DNA ser formado por duas fitas complementares, as quais podem ser facilmente desnaturadas e posteriormente renaturadas, voltando ao estado de fita dupla. Se no momento da renaturação das fitas de DNA houver fragmentos de DNA marcados (sonda) disponíveis, os mesmos hibridizarão na região de homologia dentro da célula, permitindo a sua localização precisa, tanto em cromossomos, como em núcleos interfásicos. Com a utilização dos fluorocromos, a técnica de HIS começou a ser chamada também por FISH - Fluorescent In Situ Hybridization (Revisão em Moraes, 2007).

Esta técnica foi descrita por Pardue & Gall (1969) na qual utilizavam primeiramente sondas marcadas radioativamente. Atualmente, os protocolos usam sondas não radioativas que apresentam vantagens como a alta resolução, menor tempo de processamento, estabilidade e riscos menores na manipulação. A marcação isotópica adiciona enzimas, haptenos ou fluorocromos. Os protocolos baseados na hibridação in situ não isotópica auxiliam na detecção de diferentes alvos na mesma célula por meio do uso de duas ou mais sondas marcadas diferencialmente. Atualmente a detecção é realizada por fluorocromos (moléculas que fluorescem quando excitadas por um comprimento de onda de luz ultravioleta específico) (Rogatto & Rainho, 2000).

O desenvolvimento da técnica de hibridização in situ tem possibilitado a identificação de seqüências de DNA em cromossomos mitóticos ou meióticos, em núcleos interfásicos e em fibras de cromatina estendidas. Essa técnica envolve a preparação de lâminas, o isolamento e a marcação da seqüência de DNA que se deseja localizar in situ e a sua hibridização nos cromossomos. O DNA marcado funciona como uma sonda para encontrar as seqüências do DNA cromossomal complementar a ela, chamada de DNA alvo. Para visualizar as regiões hibridizadas com sonda, é preciso associar um corante à sonda e um outro corante ao restante dos cromossomos (Brasileiro-Vidal & Guerra, 2002).

A detecção dessas seqüências de DNA tem originado grandes avanços na citogenética de plantas, destacando-se a construção de mapas físicos, a investigação detalhada da estrutura cromossômica, o acompanhamento da quantidade de cromatina introgredida em cruzamentos interespecíficos e a análise de pareamentos intergenômicos em plantas híbridas. Através da hibridização in situ, muitas seqüências de DNA têm sido visualizadas, desde cópias únicas ou com baixo número de cópias até aquelas altamente repetitivas. As primeiras seqüências detectadas foram as de DNA repetitivo, que as unidades de repetição podem estar distribuídas em tandem ou dispersas ao longo do genoma. As seqüências em tandem acontecem em blocos de centenas a milhares de cópias, localizadas em um ou mais sítios de um dado genoma. Essa categoria inclui DNA codificante, como genes para rRNA, e não-codificante, como DNA telomérico, centromérico e outros. A localização desses sítios tem fornecido importantes informações sobre a estrutura e a evolução dos genomas, além de permitir a detecção de alterações cromossômicas estruturais (Brasileiro-Vidal & Guerra, 2002).

Segundo Guerra (1988), essa técnica envolve três etapas principais. Na primeira etapa, o DNA satélite de um indivíduo é isolado e o restante do DNA é colocado num meio contendo timidina tritiada para replicação. O DNA sintetizado é uma cópia perfeita do satélite original que é radioativo. Como o DNA é uma cadeia dupla, após a replicação somente a cadeia recém sintetizada é marcada. A mesma é isolada, para ser utilizada posteriormente como indicador dos locais onde existe DNA satélite. A segunda etapa, consiste na preparação de lâminas com cromossomos do mesmo indivíduo que foi utilizado para a extração do DNA satélite. Ao preparar a lâmina sem corar, os cromossomos são tratados com soluções básicas, ou com temperaturas elevadas, que induzem a separação das duas cadeias de todo o DNA dos cromossomos. A terceira etapa, consiste na exposição desses cromossomos com as cadeias separadas à solução contendo as cadeias simples de DNA satélite marcado. Esse DNA se pareia com o DNA satélite marcado dos cromossomos com seqüências de nucleotídeos complementares à sua, revelando a localização exata desse tipo de DNA, sendo assim, a heterocromatina constitutiva do cromossomo.

A HIS pode também utilizar como sonda o DNA genômico total de uma espécie, proporcionando a marcação de todos os seus cromossomos. Esse tipo de hibridização é denominado de GISH - Genomic In Situ Hybridization. Neste caso, pode-se distinguir os cromossomos oriundos de diferentes parentais, em híbridos interespecíficos ou em espécies alopoliplóides*, bem como em estudos de similaridade genômica (Brasileiro-Vidal & Guerra, 2002). Destaca-se que as bibliotecas de DNA genômico representam uma importante fonte de seqüências para o mapeamento físico, análise estrutural do genoma, genômica comparativa e seqüenciamento do genoma, além de ser uma fonte de seqüências únicas para o mapeamento cromossômico (Hasterok et al., 2006).

As várias abordagens de hibridização in situ impostas por muitos laboratórios individuais demonstram a natureza do alvo de amostras a serem analisadas. Todos os protocolos de ensaio, devem levar em conta diversos fatores cruciais, como sua sensibilidade, poder de discriminação, precisão e confiança. As células ou tecidos devem ser pré-tratados de forma que mantenham a morfologia celular, a integridade e a posição do alvo. O tratamento deve tornar as células permeáveis o suficiente, para que seja possível a entrada da sonda do ácido nucléico e a remoção de qualquer sonda não ligada. Devem ser utilizados o tipo de seqüência e o comprimento apropriados de sonda de ácido nucléico (DNA/RNA em fita simples ou dupla), determinando a especificidade e sensibilidade do método. Além do mencionado, o tipo de marcação e o sistema de detecção devem ser cuidadosamente selecionados, pois determinam o grau de sensibilidade, facilidade de detecção e acurácia da quantificação do alvo que podem ser alcançados. Portanto, as condições de hibridização devem ser escolhidas cuidadosamente, de acordo com a natureza da sonda e aplicação desejada (Walker & Rapley, 1999).

* Alopoliplóide = um poliplóide que tem todos os conjuntos cromossômicos de espécies diferentes (Burns, 1986).

Documentos Online Nº 85 Publicações Online

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