Embrapa Trigo


		Dezembro, 2010	125
		Passo Fundo, RS

Resultados

Para fins de implementação de protocolo para transformação genética, é interessante testar previamente o(s) protocolo(s) selecionado(s) assim como os materiais genéticos candidatos a serem transformados e também as possibilidades de uso de diferentes tipos de explantes. É aconselhável correlacionar estas variáveis com a capacidade de regeneração in vitro antes de executar de fato a transformação genética, visto que a informação prévia poderá evitar o grande dispêndio de mão-de-obra, tempo e reagentes. Quanto maior a capacidade de regeneração, maiores as chances de obter eventos de transformação com um menor número de explantes iniciais. Após esta etapa, é necessário adaptar o processo de regeneração in vitro com o processo de transformação genética. Em vista disso, este estudo baseou-se em protocolos de transformação genética já publicados, ou seja, com os dois processos já otimizados. No entanto, as informações da eficiência de regeneração não estão disponíveis nos mesmos. Portanto, os dados foram comparados, principalmente, com outros trabalhos de regeneração in vitro de trigo.

Alguns explantes foram perdidos por contaminação com fungos ou bactérias. Estes explantes foram omitidos nos cálculos de percentagem de formação de calos.

Os calos formados, tanto no protocolo D quanto no PK, apresentaram coloração translúcida a cremosa, com aspecto friável, originando-se a partir da região dos ferimentos (Fig. 1). Os calos embriogênicos provenientes de embriões imaturos normalmente apresentam características de coloração leitosa, friabilidade, primórdios foliares que tornam-se clorofilados poucos dias após a exposição à luz, além da desconexão dos vasos do xilema do embrião somático com o restante do calo. No presente trabalho, como os calos não apresentaram as características macroscópicas acima descritas, a identificação da origem embriogênica ou organogênica das plântulas não ficou evidente. Este fato poderá ser verificado por análise histológica no futuro.

Todos os genótipos testados apresentaram capacidade de formação de calos, sendo que as médias observadas variaram de 83,3% (Bobwhite SH9826 – D) a 90,7% (MGS1-Aliança D) (Tabela 1). Não houve diferença significativa entre os tratamentos, ou seja, tanto a cultivar controle quanto BR18-Terena e MGS1-Aliança responderam semelhantemente em ambos os protocolos (Tabela 2).

Há vários relatos dos valores médios percentuais de indução de calos próximas a 90,0% para diversas cultivares de trigo a partir de sementes maduras (ÖZGEN et al., 1998; BI et al, 2007; HAN et al., 2007), inclusive no Brasil (NEIVERTH et al., 2010). Proporções menores também foram relatadas, variando entre 25,7% a 57,7% (CHEN et al., 2006; NASIRCILAR et al., 2006). Isto demonstra que, para esta característica, os resultados obtidos neste trabalho são satisfatórios e próximos aos limites superiores.

No entanto, para a característica calos com brotações (que poderiam originar plântulas), houve diferença estatística entre as respostas aos protocolos e para as cultivares (Tabela 3). As brotações (Fig. 2) foram observadas apenas nos calos formados no protocolo D, variando de 1,5% a 34,9% (Tabela 1). Bobwhite SH9826 e BR-18 não apresentaram diferença estatística, embora a primeira tenha a tendência de produzir maior número de calos com brotações (Tabela 4). MGS1-Aliança foi estatisticamente inferior a Bobwhite SH9826 neste quesito.

É possível que o tempo de incubação no escuro no protocolo PK tenha sido insuficiente para a indução e regeneração de calos embriogênicos, pois Patnaik et al. (2006), utilizando os mesmos meios de cultura, obtiveram média de 76,1% de formação de calos em três diferentes cultivares de trigo e regeneração de brotações média em 60,5% dos calos. Ou seja, a eficiência de regeneração, que representa o número de calos produzindo brotações por embrião utilizado como explante, foi de 46,0%. A descrição do protocolo em Patnaik; Khurana (2003) não é muito clara, o que pode ter provocado um equívoco nos procedimentos. A repetição do experimento poderia solucionar esta dúvida.

Exemplos de eficiências de regeneração relatadas em outros trabalhos são variáveis, sendo 48,6% (HAN et al., 2007), 15,0% (NEIVERTH et al., 2010), e valores médios provenientes de diferentes cultivares de 23,1%, 29,5%, 22,9% e 13,8% (NASIRCILAR et al., 2006; CHEN et al., 2006; BI et al., 2007). Portanto, para o protocolo D, a eficiência de regeneração é similar aos relatados utilizando como explante o embrião maduro. Se comparado com calos originários de embriões imaturos de Bobwhite SH9826 (eficiência de regeneração de 75%) (PELLEGRINESCHI et al., 2002), a eficiência de regeneração dos calos de embriões maduros ainda é muito inferior, embora não impossibilite a transformação genética.

A maioria das brotações produzidas foram únicas, mas ocorreram explantes com duas e três brotações (Tabela 5). Este fato é desejável porque aumenta o número de brotações por calo e, consequentemente, a probabilidade de obter plantas transformadas. Não foi verificado se as multibrotações possuem a mesma origem celular ou se são originárias de diferentes células. A vantagem da produção de brotações múltiplas originadas de diferentes células é aumentar a probabilidade de obtenção de diferentes eventos de transformação genética. No caso de ser originária da mesma célula inicial, a vantagem seria ter clones do mesmo evento, diminuindo as chances de perda durante a aclimatação. Tanto neste aspecto quanto na percentagem de calos com brotações, BR18-Terena foi comparável à Bobwhite SH9826 enquanto MGS1-Aliança apresentou valores inferiores (Tabelas 3, 4, 6 e 7), indicando que esta última é a menos indicada para ser submetida à transformação genética.

Zale et al (2004) obtiveram uma média de 0,39 brotações/calo, 0,31 brotações/ embrião maduro, para 29 cultivares e linhagens de trigo. Neste trabalho, calos provenientes de embriões maduros de Bobwhite produziram 0,63 brotações/calo, enquanto que de embriões imaturos produziram 2,9 brotações/calo, evidenciando a superioridade do último explante. Já em Özgen et al (1998), foi obtida uma média de 0,26 brotações/calo e 0,23 brotações/embrião. Novamente, os resultados obtidos no presente trabalho encontram-se próximos e às vezes até superiores às médias de dados já relatados.

Documentos Online Nº 125 Publicações Online