Embrapa Trigo


		Dezembro, 2010	125
		Passo Fundo, RS

Material e métodos

1. Material vegetal

Os genótipos utilizados foram: Bobwhite SH9826 (controle responsivo à regeneração in vitro e transformação genética), BR18-Terena (cultivo de sequeiro, moderadamente tolerante ao déficit hídrico), MGS1-Aliança (cultivo de sequeiro, tolerante ao déficit hídrico).

As sementes foram desinfestadas em etanol 70% (v/v) durante cinco minutos, seguida de imersão em solução de água sanitária comercial 50% (v/v) e Tween 20 a 0,1% (v/v) durante 20 minutos, e cinco enxágues com água estéril. Após o último enxágue, foram mantidas sob agitação de 100 rpm em água estéril durante 2 horas a 33 ºC. Em condições assépticas, foram efetuados três ferimentos nas sementes (cortes com lâmina de bisturi) na região do embrião. Os explantes foram preparados desta maneira de acordo com experimento preliminar, onde esta forma de cortes proporcionou maior percentagem de formação de calos. As sementes foram colocadas em placas de petri contendo meio de cultura, com a região dos ferimentos em contato com o meio. Para cada tratamento foram utilizadas seis placas, cada uma contendo 15 explantes (sementes), totalizando 75 explantes, mantidas em salas de cultura a 25±2ºC, no escuro ou com intensidade luminosa de 30 µmol.m^-2.s^-1 e 16 h de fotoperíodo.

2. Protocolos e meios de cultura

Os protocolos utilizados neste trabalho foram originalmente utilizados para transformar trigo via Agrobacterium tumefaciens (DING et al., 2009) ou bombardeamento de partículas (PATNAIK; KHURANA, 2003). Para estes ensaios, foram aplicados somente as etapas de regeneração de plantas e não foram utilizados antibióticos, herbicidas, acetosiringona ou adjuvantes. Os meios de cultura foram separados em dois volumes para a esterilização: 40% contendo o ágar foi autoclavado e 60% contendo os componentes restantes foram filtroesterilizados. Antes de serem misturados e vertidos nos recipientes adequados, a temperatura dos meios de cultura foi ajustada para próximo de 55 °C, sendo suportável ao manuseio.

2.1 – Protocolo D – Ding et al. (2009), com modificações

a) As sementes foram colocadas em meio de pré-cultivo/indução (macro e micronutrientes MS (MURASHIGE; SKOOG, 1962), FeNa₂.EDTA MS, vitaminas MS, 100 mg/l de inositol, 500 mg/l de glutamina, 100 mg/l de caseína hidrolisada, 100 mg/l de ácido ascórbico, 1,95 g/l de MES, 40 g/l de maltose, 1 mg/l de picloram, 7 g/l de ágar e pH 5,7) no escuro durante 14 dias, na sala de cultura;

b) em seguida, as sementes foram transferidas para o mesmo meio de cultura e mantidas por três semanas no escuro;

c) após este período, os calos foram separados do tecido original, transferidos para o meio R_DZ (macro e micronutrientes L7, vitaminas MS, FeNa₂.EDTA MS, 100 mg/l de inositol, 30 g/l de maltose, 5 mg/l de zeatina, 0,1 mg/l de 2.4-D, 7 g/l de ágar e pH 5,7) e mantidos durante mais três semanas na luz;

d) em seguida, as plântulas regeneradas foram transferidas para o meio de Regeneração (macro e micronutrientes L7, vitaminas MS, FeNa₂.EDTA MS, 100 mg/l de inositol, 30 g/l de maltose, 7 g/l de ágar e pH 5,7) e mantidas durante três semanas, sendo então efetuada a avaliação.

O gelificante citado no protocolo original é o agargel a 6 g/l, mas foi substituído pelo ágar a 7 g/l, assim como 200 mg/l de inositol foi substituído por 100 mg/l de inositol.

O tempo requerido até o final do protocolo é de 75 dias.

2.2 – Protocolo PK – Patnaik & Khurana (2003), com modificações

a) As sementes foram colocadas em meio MSE2 (macro e micronutrientes MS, vitaminas MS, FeNa₂.EDTA MS, 100 mg/l de inositol, 200 mg/l de caseína hidrolisada, 2 mg/l de 2,4-D, 30 g/l de sacarose, 7 g/l de ágar e pH 5,8) e mantidas no escuro durante duas semanas, na sala de cultura;

b) os calos do tecido original foram separados do tecido original e transferidos para novo meio MSE2, na luz, e mantidos por três semanas;

c) após este período, os calos foram novamente transferidos para MSE2 e mantidos por mais três semanas;

d) os calos foram transferidos para o meio MSER (macro e micronutrientes MS, vitaminas MS, FeNa₂.EDTA MS, 100 mg/l de inositol, 200 mg/l de caseína hidrolisada, 0,5 mg/l de BAP, 0,02 mg/l de NAA, 30 g/l de sacarose, 7 g/l de ágar e pH 5,8) e mantidos por duas semanas;

e) os calos foram transferidos para o meio ½ MS (metade da concentração macro e micronutrientes MS, metade da concentração das vitaminas MS, metade da concentração de FeNa₂.EDTA MS, 50 mg/l de inositol, 15 g/l de sacarose, 7 g/l de ágar e pH 5,8), mantidos por três semanas e avaliados.

O tempo requerido até o final do protocolo é de 77 dias.

3. Avaliações

Foram avaliados o percentual da indução de calos considerando o número de explantes com formação de calos em relação ao número de explantes iniciais; o percentual de regeneração de plantas considerando o número de plantas regeneradas em relação ao número de calos formados e a quantidade de brotações por calo, considerando todos os calos formados, com ou sem brotações. Foi avaliada também a eficiência de regeneração, representada pela razão entre o número de calos que regeneraram e o número total de explantes iniciais.

Os experimentos foram conduzidos em delineamento inteiramente casualizado.

As análises estatísticas foram realizadas em três etapas, nas quais procuraram-se avaliar a influência dos efeitos das cultivares e protocolos nas informações/medições obtidas em cada etapa do experimento, na seguinte sequência: (i) modelo logístico para ajuste da probabilidade de se obter calos; (ii) modelo de Poisson para ajuste do número de calos com brotações, na presença de super dispersão e ponderados pelo número de calos obtidos na etapa (i) e (iii) modelo de Poisson para ajuste do número de brotações por calo, ponderados pelo número de calos com brotação obtidos na etapa (ii). Todas as análises foram realizadas no software estatístico R (THE R PROJECT... 2010) e o nível de significância foi fixado ao nível de 5% de probabilidade.

Documentos Online Nº 125 Publicações Online