Puccinia triticina Erikss é o fungo causador da ferrugem da folha do trigo, principal doença que prejudica o cultivo da espécie, acarretando danos econômicos significativos, conforme as condições ambientais e o ano de cultivo. Este fungo é biotrófico, ou seja, é um parasita obrigatório que apresenta alta especialização fisiológica. Conforme Simons (1985), este fungo é capaz de colonizar a região intercelular dos tecidos vegetais e desenvolver haustórios. Estas estruturas retiram os nutrientes da célula viva da planta, resultando diretamente na diminuição da produtividade. Este patógeno tem grande habilidade em superar genes de resistência específicos (SINGH; HUERTA-SPINO, 2001), fato que contribui para que haja grande quantidade de inóculo disponível ao longo de todo o ano, facilitando a seleção e a fixação de isolados com novas combinações de virulência (CHAVES; BARCELLOS, 2006).

A população de P. triticina é extremamente dinâmica, sendo frequente o surgimento de novas raças, as quais podem se tornar importantes devido à sua extensa disseminação e/ou pela superação da resistência de uma cultivar amplamente cultivada. No Brasil, os prejuízos provocados pela ferrugem da folha ocorrem anualmente e, normalmente, entre uma e três raças novas do patógeno são detectadas a cada ano (CHAVES et al., 2005). Assim, análises genéticas destes materiais são fundamentais para compreender o mecanismo evolutivo e a diversidade genética da espécie.

A extração de DNA é o primeiro passo para a sua utilização em diferentes técnicas com marcadores moleculares. Existem diferentes protocolos de extração de DNA, com variações de acordo com a espécie e o tecido a ser utilizado para a extração. Em geral, utiliza-se a maceração do organismo/tecido alvo em nitrogênio líquido para o rompimento da parede celular, um tampão com detergente para o rompimento da membrana celular (com pH 8,0 para impedir a ação das nucleases), reagentes como fenol e/ou clorofórmio para a desnaturação das proteínas, agentes antioxidantes para evitar a oxidação de polifenóis e inibição da atividade de peroxidases e polifenoloxidases, proteinase K para facilitar a separação do DNA das proteínas da cromatina, etanol para limpeza e precipitação do DNA e enzima RNAse para digestão e eliminação do RNA (BONATO, 2008).

Existem alguns métodos descritos para a extração de DNA de fungos, tais como os de Raeder; Broda (1985), Zolan; Pukkila (1986), Anikster et al. (1997) e Brake et al. (2001). Entretanto, estes protocolos não são específicos para a extração de DNA de P. triticina. Conforme Ferreira; Grattapaglia (1998), alterações em protocolos muitas vezes são necessárias devido as diferenças na constituição dos tecidos de cada espécie. Duan et al. (2003) descreveram um protocolo para a extração de DNA de P. triticina, porém a quantidade de DNA extraída com este protocolo foi muito reduzida.

A conservação do material a ser utilizado na extração de DNA também é um fator crítico que está diretamente relacionado com a qualidade do produto final da extração. Diferentemente do que ocorre com as folhas das plantas, que necessitam ser imediatamente congeladas após a sua coleta ou armazenadas em sílica para que o material genético seja mantido integralmente, os esporos dos fungos não precisam ser mantidos congelados. A conservação dos esporos pode ser realizada, a curto prazo a 4 ºC ou, a longo prazo, em vácuo e, neste caso, também armazenados a 4 ºC. Entretanto, se a pressão utilizada no vácuo não for realizada de modo correto, torna-se um fator limitante para a conservação do material. Quando os esporos mudam a sua coloração inicial (de amarelo-dourado para cinza-escuro), eles podem estar em processo de degradação, o que pode interferir na qualidade e quantidade de DNA extraído.

Sendo assim, o objetivo deste trabalho foi otimizar uma metodologia para a extração de DNA do fungo P. triticina.

Descrição do protocolo de extração de DNA de Puccinia triticina

Este protocolo foi desenvolvido a partir de Duan et al. (2003). As alterações foram necessárias, uma vez que o protocolo original não apresentou eficiência nos materiais testados, resultando na obtenção de quantidades insignificantes de DNA. Por esta razão, alguns testes foram desenvolvidos, resultando no protocolo descrito a seguir.

1) Pese 20 mg de esporos de cada amostra em tubos de 2 mL;

2) Adicione 600 µL de tampão de extração (Tabela 1) e 15 µL de Proteinase K (10 mg/mL);

3) Em seguida, incube a 65 ºC por 2h em banho-maria;

4) Mantenha em temperatura ambiente durante 5 minutos;

5) Adicione 600 µL de solução de clorofórmio-álcool isoamílico (24:1) e agite levemente invertendo por, aproximadamente, cinco minutos;

6) Centrifugue a 4 ºC, durante 25 minutos, à 14000 rpm;

7) Transfira o sobrenadante para um tubo novo de 2 mL;

8) Adicione 400 µL de isopropanol gelado;

9) Armazene a – 20 ºC durante 24 horas;

10) Centrifugue a 4 ºC, durante 20 minutos, a 13000 rpm;

11) Descartar o sobrenadante;

12) Adicione 1 mL de etanol 70 % gelado;

13) Centrifugue durante um minuto, a 13000 rpm;

14) Elimine o sobrenadante e deixe o pellet de DNA secar em temperatura ambiente durante 60 minutos;

15) Adicione 30 µL de TE (Tris pH 8 10 mM + EDTA 1 mM) + RNase (10 mg/mL) e mantenha a 37 ºC durante 90 minutos;

16) Armazene a 4 ºC durante 24 horas e proceda a quantificação do DNA, que pode ser realizada em gel de agarose 0,8 % (Tabela 2).

Resultados

As alterações propostas, a partir do protocolo de Duan et al. (2003) estão descritas a seguir, bem como as principais etapas ilustradas na Figura 1:

a) Quantidade de esporos:

Duan et al. (2003) sugerem a utilização de 10 mg de esporos por amostra, entretanto, a quantidade indicada resultou na extração de quantidades insignificantes de DNA. Por esta razão, foram realizadas extrações de DNA com 10, 20 e 30 mg, para verificar a quantidade mais adequada. Nas amostras testadas com 10 mg de esporos não foi possível determinar a quantidade de DNA extraída e, nas amostras com 30 mg, não foram observadas diferenças significativas em relação às amostras com 20 mg. Por esta razão, determinou-se que 20 mg de esporos seria a quantidade ideal para a obtenção de, pelo menos, 50 ng de DNA/µL (Fig. 2). Entretanto, a qualidade do DNA permaneceu baixa. Por esta razão foram testadas outras alterações.

b) Tampão de extração:

A alteração na concentração de NaCl no tampão de extração, de 0,8 M para 5 M também melhorou a qualidade do DNA extraído. É importante ressaltar que o NaCl dissocia-se em solução, em íons Na⁺ e Cl^-, os quais interagem com os grupamentos fosfatos do DNA, neutralizando e estabilizando as moléculas. Contudo, recomenda-se que o preparo do tampão seja feito sempre no momento de seu uso.

c) Tempo de incubação a 65 °C:

A 65 °C, a parede celular dos fungos é degradada. Além disso, nesta temperatura, algumas enzimas tais como as DNases desnaturam-se, impedindo que danifiquem o DNA. O período de incubação proposto foi de 30 minutos a mais, ou seja, 2h ao invés de 1h e 30 min.

d) Volume de soluções e velocidade de rotação na centrífuga:

Volumes de soluções como clorofórmio-álcool isoamílico (24:1), isopropanol e TE foram testados concluindo-se que, ao invés de 500 µL, 1 volume e 20 µL, respectivamente, a utilização de 600 µL de clorofórmio-álcool isoamílico (24:1), 400 µL de isopropanol e 30 µL de TE eram mais adequadas.

Da mesma forma, a utilização de diferentes velocidades de centrifugação (rpm) resultaram na formação de um pellet de DNA maior e mais compacto.

Observações: A extração de DNA de esporos conservados há mais de um ano (à vácuo, a 4 °C e – 20 °C) que apresentavam alterações na sua coloração original (de dourado para acinzentado) não foi eficiente. Dessa forma, o protocolo descrito não é indicado para a extração de P. triticina com esporos com alteração na sua coloração original.

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Referenciação

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