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Anexo 1

ANEXO 1 - PREPARO DAS SOLUÇÕES

Tampão CTAB (50 mL)

	Concentração Final	Volume final de 50 mL
Tris-HCl 1M pH 8	100 mM	5,0 mL
NaCl 5M	1,4 M	14,0 mL
EDTA 0,5 M	20 mM	2,0 mL
CTAB 10%	2%	2,0 mL
Água Milli-Q		qsp 50 mL

Tris-HCl 1 M pH 8,0 (100 mL)

Dissolver 12,1 g de Tris base em 80 mL de água Milli-Q, sob constante agitação.

Ajustar o pH para 8,0 adicionando HCl concentrado (aproximadamente 4,2 mL).

Resfriar a solução até a temperatura ambiente e então ajustar pH final para 8,0.

Completar o volume para 100 mL com água Milli-Q.

 

Tris-HCl 10 mM pH 8,0 (10 mL)

Fazer diluição a partir do Tris-HCl 1 M pH 8,0. Adicionar 100 L de Tris-HCl 1 M pH 8,0 em 9,9 mL de água Milli-Q.

C_iV_i = C_fV_f

1.000 mM x V_i = 10 mM x 10 mL

V_i = 0,1 mL de Tris-HCl 1 M pH 8,0

 

Solução de RNase 10 mg/mL (1 mL)

Dissolver 10 mg de ribonuclease A (Sigma, cat. N. R-5500, estocado a -20 °C) em 1 mL de Tris-HCl 10 mM pH 7,5 e NaCl 15 mM. Aquecer a 95 °C por 10 min e colocar imediatamente em gelo por 5 min. Estocar a -20 °C.

Solução para precipitação seletiva de polissacarídeos (500 L)

	Concentração final	Volume final de 500 L
Tris-HCl 1M pH 8,0	10 mM	5 L
NaCl 5M	0,25 M	25 L
Água Milli-Q		470 L

Gel de agarose 0,8%

Para 70 mL (quantidade necessária para cuba de eletroforese pequena):

• 0,56 g de agarose ultra-pura

• 70 mL de TBE 1x

• 1,5 L de brometo de etídeo

Aquecer a solução contendo o tampão e agarose até que a mesma esteja completamente dissolvida (pode ser em microondas). Deixar esfriar e quando a solução estiver morna, diluir o brometo de etídeo e verter na cuba de eletroforese.

HCl 1N (300 mL)

Colocar, primeiramente, 275 mL de água destilada em uma proveta e após, acrescentar 25 mL de HCL.

 

HCl 6N (300 mL)

Colocar, primeiramente, 150 mL de água destilada em uma proveta e após, acrescentar 150 mL de HCL.

 

HCl 10 mM (50 mL)

Colocar, numa proveta, 40 mL de água destilada, adicionar vagarosamente 0,5 mL de HCl 1 N e completar para 50 mL.

 

Solução 20x SSC (1 L)

Dissolver 175,6 g de NaCl e 88,2 g de C₆H₅Na₃O₇.2H₂O em 500 mL de água destilada. Completar para 1 L.

Solução 2x SSC (1 L)

Diluir 100 mL de 20x SSC em 900 mL de água destilada e misturar uniformemente.

 

Pepsina estoque 1 mg/mL (5 mL)

Pesar 5 mg de pepsina e dissolver em 5 mL de HCl 10 mM. Observar sempre o grau de pureza do produto.

Solução 10x PBS

1 L: 1,3 M NaCl (75,8 g NaCl), 70 mM Na₂HPO₄ (12,45 g Na₂HPO₄.2H₂O ou 9,93 g de Na₂HPO₄ anidro) e 30 mM NaH₂PO₄ (4,14 g NaH₂PO₄.H₂O) dissolvidos em 1 L de água destilada e o pH ajustado para 7,0.

300 mL: 1,3 M NaCl (22,74 g NaCl), 70 mM Na₂HPO₄ (3,735 g Na₂HPO₄.2H₂O ou 2,979 g de Na₂HPO₄ anidro) e 30 mM NaH₂PO₄ (1,242 g NaH₂PO₄.H₂O) dissolvidos em 300 mL de água destilada e o pH ajustado para 7,0.

 

Obs. Caso não se tenha NaH₂PO₄.H₂O, mas somente NaH₂PO₄ (anidro), calcula-se a exclusão da molécula de H₂O.

NaH₂PO₄.H₂O -------- 4,14g -------- 138 (PM)

NaH₂PO₄ -------- x -------- 120 (PM)

x = 3,6 g de NaH₂PO₄

Solução 1x PBS (500 mL)

Diluir 50 mL de 10x PBS em 450 mL de água destilada e misturar uniformemente.

NaOH 1N (10 mL)

Dissolver 0,4 g de NaOH em 10 mL de água destilada.

Solução de formamida (pura - Sigma) para estocagem (deionização)

Pesar a resina BioRad [Analytical grade mixed bed resin (Ag 501-x8 Resin; 20-50 mesh, ready to use] e adicionar à formamida líquida, em uma proporção de 1:10. Quando a resina passar de uma coloração azulada para dourada, filtrar a solução e estocar a -20 °C. Ela deverá congelar.

 

Solução de dextran sulfato 50% para estocagem (4 mL)

Pesar 2 g de dextran sulfato (Sigma) e dissolver em 4 mL de água destilada. Em seguida, filtrar a solução em filtro de esterilização de 20 m, preparar alíquotas de 1 mL e estocar a - 20 ºC.

 

Solução 0,1x SSC (1 L)

Diluir 5 mL de 20x SSC em 995 mL de água destilada e misturar uniformemente.

C₁V₁ = C₂V₂

20x x V₁ = 0,1x x 1000

V₁ = 5 mL

 

Solução 4x SSC + 0,1% de Tween 20 (1 L)

Diluir 200 mL de 20x SSC em 800 mL de água destilada e misturar uniformemente. Acrescentar 1 mL de Tween 20.

C₁V₁ = C₂V₂

20x x V₁ = 4x x 1000

V₁ = 200 mL

 

Solução de BSA 5% em 4x SSC + 0,1% Tween 20

Pesar 0,25 g de BSA, adicionar em 5 mL de 4x SSC + 0,1% Tween 20 e esperar que o BSA se dissolva sozinho (cerca de 1 h). Ajudar, se necessário, com um bastão de vidro. Evitar a formação de espuma, a fim de preservar a atividade do produto. Em seguida, filtrar a solução, distribuir em alíquotas e estocar a -20 °C.

Solução de BSA 1% em 4x SSC + 0,1% Tween 20

Pesar 0,05 g de BSA e dissolver em 5 mL de 4x SSC + 0,1% Tween 20 (ver recomendações no Anexo 1). Filtrar a solução, distribuir em alíquotas e estocar a -20 °C.

 

Solução DAPI-Vectashield

Para 500 L de solução, misturar de modo homogêneo 250 L de DAPI (previamente preparado, 2 g/mL) + 250 L de Vectashield. Esta solução deve ser guardada sempre a -20 °C.