Com o objetivo de detectar variações no volume nucleolar em cultivares de trigo na presença de alumínio em solução, foi realizado um experimento no Laboratório de Biotecnologia da Embrapa Trigo, usando as seguintes cultivares: BH 1146 (tolerante ao alumínio) e Anahuac (sensível). Sementes de ambas as cultivares foram obtidas do Banco Ativo de Germoplasma da Embrapa Trigo. A seguir serão descritos os principais passos envolvidos na técnica:

1) Semeadura e coleta de raízes em solução com alumínio:

Para cada cultivar foram preparadas placas de petri contendo fina camada de algodão e, sobre estas, papel germitest, a fim de permitir a germinação das sementes. As sementes foram embebidas com 80 mL de solução de alumínio, sendo realizados quatro diferentes tratamentos: a) controle com água destilada, b) solução contendo 2 mg Al/L, c) solução contendo 4 mg Al /L; e d) solução contendo 20 mg Al/L.

Antes da semeadura, as sementes foram desinfectadas com solução de hipoclorito de sódio a 50%, seguida de lavagem com álcool a 70 %. As placas com as sementes foram mantidas em germinador a 20 °C, por 5 dias, ou até que tivesse sido emitida a raiz e esta apresentasse a região meristemática bem desenvolvida.

2) Coleta de raízes e pré-tratamento:

A coleta das raízes foi realizada quando estas apresentavam aproximadamente 2 cm de comprimento. As raízes foram cortadas e mergulhadas em água destilada, permanecendo a 4°C, por 24 h, no escuro.

3) Fixação das pontas de raízes:

A fixação foi feita utilizando-se três partes de álcool etílico (P.A.) para uma parte (3:1) de ácido acético glacial (P.A.), por 24 horas em temperatura ambiente. Após a fixação do material, as raízes foram transferidas para álcool 70%, conservando as mesmas a temperatura de -20°C.

4) Preparo de lâminas:

Para a análise do volume nucleolar, foram consideradas 10 células bem individualizadas de cada cultivar, em três repetições. Primeiramente, fez-se a lavagem das raízes em água destilada, por três vezes, trocando-se a água a cada 5 minutos, a fim de eliminar resíduos do fixador e/ou do álcool 70%. Após, realizou-se a hidrólise das raízes, imergindo as mesmas em HCl 5N, por 1 minuto, em câmara úmida a 60º C. Para o preparo das lâminas, foi retirado somente a ponta das raízes, mantendo a integridade da região meristemática. O esmagamento do material foi realizado, colocando uma única gota de ácido acético 45% sobre a lâmina, quando foram realizados pequenos cortes, com auxílio de um bisturi. Em seguida, colocou-se a lamínula sobre o tecido macerado e pressionou-se esta por meio de uma prensa específica para confecção de lâminas. As lâminas, foram então armazenadas a – 20ºC até o momento da coloração.

5) Separação lâmina-lamínula e coloração:

Separou-se a lâmina da lamínula mergulhando cada uma delas em nitrogênio líquido e removendo-a com o auxílio de um bisturi. Após esta etapa, fez-se a coloração, na qual foi primeiramente usada uma gota de solução de gelatina e duas gotas de solução de AgNO₃, colocando-se imediatamente a mesma lamínula, que foi retirada anteriormente, mantendo-se em câmara úmida a 60°C, até que a coloração obtivesse aspecto "marron-amarelado", conforme o método descrito por Boscardin (2005).

6) Avaliações: