Setenta e quatro isolados foram coletados em lavouras de trigo com sintomas de mancha amarela no Rio Grande do Sul, Santa Catarina, Paraná e Mato Grosso do Sul (Fig. 1). Os pontos de coleta foram georreferenciados e plotados em imagem de satélite obtida no Google Earth.

Cada amostra foi coletada e encaminhada (em sacos de papel) ao Laboratório de Fitopatologia da Embrapa Trigo, onde se procederam os isolamentos do fungo em meio de cultura.

Isolamento

Para o isolamento do fungo, foram cortados pequenos pedaços das folhas com sintomas (aproximadamente de 2 x 2 mm), e dentro de um pequeno bequer, em câmara de fluxo laminar, realizada a assepsia com água destilada e autoclavada, acrescida de hipoclorito de sódio (2,0 -2,5%) na proporção de 1:1 por 1 minuto, seguida de enxágüe com água destilada e autoclavada. Em seguida os pedaços de folha, cinco fragmentos em cada placa, foram dispostos diretamente sobre meio BDA + streptomicina (0,12 g/L). Dois a quatro dias após, os micélios de fungo em crescimento, que apresentavam características do patógeno buscado, foram repicados para novas placas contendo V8-BDA (150ml suco V8, 10 agar, 10 BDA Merck, 3g CaCO₃) até a obtenção da cultura pura.

Produção de Esporos

O processo de produção de esporos foi utilizado tanto para confirmação do patógeno quanto para inoculações em plantas, de acordo com Lamari et al. (1995) com modificações. Para tanto, o fungo foi repicado para uma placa nova de V8-BDA, permanecendo cinco dias para crescimento a 25 ± 1°C no escuro. No quinto dia, com um tubo de ensaio esterilizado, foi feito um esmagamento do micélio, procedimento essencial para que o fungo esporule. Em seguida as placas foram transferidas para outro ambiente onde permaneceram por 24 h de luz à 25 ± 1°C, período em que se desenvolvem conidióforos, seguido de mais 24h de escuro a 15 ± 1°C, necessários para a formação de conídios. A confirmação do isolamento do patógeno foi feita no sétimo dia, quando era observado ao microscópio esteroscópico a formação abundante de esporos.

Armazenamento

Após a confirmação dos isolados, pequenos discos de meio V8-BDA contendo o fungo foram dispostos por uma noite em câmara de fluxo laminar para desidratar o meio. Em seguida os discos secos foram armazenados em freezer, onde permanecem viáveis por pelo menos um ano. Para recuperá-los, basta recolocá-los em meio de cultura (BDA ou V8-BDA).

Inoculação

O inóculo foi preparado vertendo-se pequena quantidade de água sobre o fungo com esporos, os quais são liberados com o auxílio de um pincel macio. Para ajuste do número de esporos a serem inoculados utilizou-se Câmara de Neubauer, ou uma simples regra de três aplicada em três repetições de gotas de 5µl da suspensão de esporos. Então o volume foi ajustado para aproximadamente 3.000 esporos/mL. Com tal suspensão de esporos plantas no estágio de 2 folhas foram pulverizadas completamente até o ponto de escorrimento pelas folhas. Após a inoculação as plantas foram mantidas em regime de umidade intermitente de 30 segundos a cada 30 segundos, por 48 horas, de acordo com Lamari et al. (1995) com modificações. Em seguida as plantas são transferidas para casa-de-vegetação onde permaneceram por mais cinco dias até a avaliação dos sintomas, para a qual foi utilizada uma escala de notas adaptada de Lamari & Bernier (1989).

Identificação das raças

Para identificação das raças cada isolado, previamente armazenado como descrito acima, foi recuperado por reidratação e repicado para novas placas contendo V8-BDA. Plantas diferenciadoras são inoculadas conforme procedimento descrito acima. As plantas diferenciadoras foram as cultivares Glenlea, Salamouni, Katepwa, 6B365 e ND495, nas quais a identificação das raças foi realizada conforme a Tabela 1. Vinte e quatro isolados foram utilizados para identificação de raças.